2023年6月23日，《Genome Biology》期刊发表了题为《CATI: an efficient gene integration method for rodent and primate embryos by MMEJ suppression》的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）刘真研究组和非人灵长类研究平台孙强团队合作完成。研究人员通过使用RNA基因编辑工具CasRX下调参与MMEJ修复的关键基因DNA聚合酶θ（polq），在小鼠胚胎中显著提高了线性化双链DNA以及单链短DNA片段（ssODN）外源模板的基因敲入效率，该基因敲入方法被命名为CATI（CasRX-assisted targeted integration）（图1）。此外，利用CATI的方法也能提升食蟹猴胚胎基因敲入的效率。 

　　图1 CATI策略的原理图 

　　对哺乳动物基因组进行精准基因整合是一项低效，但具有重要价值的研究手段。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑工具的出现，为制备精准基因编辑的动物模型提供了高效手段。CRISPR/Cas9系统利用Cas9核酸酶与单链导向RNA（sgRNA），通过有效诱导基因组中特定位点发生DNA双链断裂（DNA double strand break, DSB），从而进行基因组编辑。DSB主要由非同源末端连接（NHEJ）、微同源末端连接（MMEJ）和同源重组（HDR）三种机制来修复。相比NHEJ和MMEJ修复途径中不可预测的碱基插入或者删除，HDR通路利用与DSB位点周围区域具有同源序列的模板（内源性或外源性DNA）为供体模板，以精确重组的方式修复DNA，可以实现基因组DNA的精准基因插入、删除以及单个核苷酸的替换。因此，基于HDR的基因编辑方法为开发安全、高精度的人类疾病基因治疗技术提供了基础。然而，在哺乳动物细胞基因组中，HDR修复效率非常低，这限制了精准编辑在哺乳动物细胞中的应用。近年来，很多研究人员致力于从抑制NHEJ、激活HDR通路、控制细胞周期等方面提高HDR效率（Ma et al., Cell Res, 2017; Zhao et al., Nucleic Acids Res, 2022; Quadros et al. Genome Biol., 2017）。 

　　该研究针对21个基因位点设计了88条sgRNA，对1500枚小鼠胚胎进行基因编辑，通过Sanger测序鉴定sgRNA的编辑效率以及靶标位点的DNA修复模式。分析发现sgRNA编辑的效率越高，MMEJ修复模式所占的比例越高。注射后胚胎的RNA-seq及Q-PCR数据表明，外源DNA模板的存在会诱导MMEJ修复的核心蛋白polq的基因表达上升。通过结合Cas9介导的基因敲入和CasRX介导的Polq基因敲低的CATI策略，研究人员成功在小鼠十多个位点上实现了基因敲入效率的提升，其中3个位点的胚胎通过移植获得了基因敲入小鼠，这些小鼠敲入的基因型可以被传递到下一代，证明了CATI在动物模型构建中的应用潜力。 

　　该研究还以脑智卓越中心杨辉研究组提出的线性化供体模板为基础（Yao et al., Dev Cell, 2018），在小鼠胚胎水平上，整体比较分析了此前已经报导的10种具有代表性的基因敲入效率提升方法。发现二细胞时期胚胎注射策略（Gu et al., Nat Biotechnol, 2018）可以被稳定重复，在与CATI策略结合后可以进一步提升敲入效率，在Actb位点的敲入效率最高达到了91.3%。此外，CATI在非人灵长类胚胎中同样可以提升效率，在测试的CDX2位点上，敲入效率从37.9%提升到64.9%，在H3.3B位点上从50.8%提升到74.5%。 

　　最后，研究人员对CATI策略进行了全面的安全性评估。GOTI实验表明，CATI技术并不会引入更多的突变和基于Cas9的脱靶；全基因组进行序列分析同样发现，CATI不会引入更多的外源DNA模板的随机整合；对编辑位点附近序列进行三代测序发现，CATI可以有效减少大片段的缺失。CATI策略为疾病动物模型的开发以及基因疾病的临床治疗提供了新的选择。 

　　脑智卓越中心陈红玉博士、博士研究生刘星辰和硕士研究生李兰心为该论文共同第一作者。刘真研究员、孙强研究员、陆宗阳博士为该论文的共同通讯作者。该研究得到科技部、中国科学院、上海市和基金委的资助。感谢脑智卓越中心光学成像平台、分子细胞技术平台和实验动物平台对本工作提供的有力支持。 

　　来源：刘真研究组、非人灵长类研究平台 

　　文字：刘真、陈红玉 

　　图片：刘真、陈红玉