2024年11月22日，《Nature Methods》期刊在线发表了题为《Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons in behaving animals》的研究论文。该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）王凯研究组完成。研究团队开发了一种新型超分辨显微成像技术，有效解决了背景噪声干扰和运动伪影两大技术难题，可在清醒动物脑中对神经元的快速动态进行超分辨率光学成像和解析，为研究动物学习过程中的神经元突触可塑性基础提供了有力的新工具。

理解微观生命过程如何有机构成宏观生命体，并实现复杂的生理功能，是生命科学的重要研究内容。然而，受限于研究技术手段，微观动态的研究通常需要在简化的离体实验中开展，使其难以与宏观生命现象如动物的睡眠和学习行为等直接建立联系。在神经科学研究中，解析突触的形态和功能可塑性是探究学习记忆底层机理，进而理解大脑工作原理的重要基础。神经元突触是神经网络连接的关键结构。在学习记忆等过程中，神经网络连接权重的改变和突触形态的变化高度相关。使用活体动物双光子显微成像技术捕捉突触在学习记忆、睡眠和疾病等过程中的形成和消亡，极大提升了对神经元形态可塑性和脑功能之间联系的认识。然而，受限于光学衍射效应，传统光学显微镜，包括双光子显微镜，无法突破200~300纳米的分辨率极限，难以进一步观察研究更精细的结构和动态。近年来，新发展的超分辨光学显微成像技术可突破光学衍射极限，并已经为突触研究带来了一场技术革命。然而，由于面临多项技术难点，目前超分辨率荧光显微镜多应用于离体的细胞和脑片研究，尚未有技术能够在清醒动物中超分辨解析正常生理和行为状态下突触的结构和功能。因此，开发能够应用于清醒动物的超分辨光学成像新技术一直是神经科学和光学成像技术领域的长期愿景和技术前沿。

发展可应用于清醒动物的超分辨成像技术面临两个主要的技术难题，背景噪声干扰和运动伪影。单分子定位（PALM\STORM）和结构光照明（SIM）超分辨成像技术基于宽场成像，受背景噪声干扰严重。同时，这些技术需要样品在保持静止的状态下采集多张图片来重构一张超分辨图片，难以容忍动物呼吸和心跳造成的微小移动。受激发射损耗显微镜（STED）基于点扫描成像，可通过共聚焦机制滤除背景噪声干扰，但其需要较长的信号积累时间，受运动伪影干扰严重，只尝试在麻醉动物中开展小视场成像。为了同时解决这些技术难题，研究团队创新提出了多模式复用结构光线照明超分辨显微成像技术（MLS-SIM）。该技术的关键创新在于提出了在单次线扫描成像过程中，通过快速切换不同的线照明模式来分别获得三个方向上的超分辨信息，并提出新的超分辨重构理论框架，实现准确高效的超分辨图像重构。在线性荧光激发模式下，MLS-SIM可以150纳米横向分辨率对清醒小鼠皮层中神经元树突棘尖刺和轴突终扣微观动态开展长达上千帧的连续成像，速度达每秒数帧，可容忍每秒50微米的样品运动而不影响其超分辨成像性能。进一步，利用皮秒脉冲激光实现非线性荧光激发，非线性MLS-SIM可以将横向分辨率提高至约100纳米，且保持同样的样品运动容忍度。

多模式复用结构光线照明超分辨显微成像技术填补了超分辨显微镜在清醒动物上开展成像的空白，并弥补了以往技术在活体动物成像时长和光漂白特性上的不足，为在体微观研究提供了广阔的前景。利用该技术，研究团队在清醒的小鼠大脑中验证了神经元树突棘和轴突终扣上存在着快速变化的尖刺动态，并量化研究了清醒-睡眠循环中神经元的微观快速动态的改变。该技术还实现了双色超分辨同时成像，探究了PSD-95蛋白聚团的微观结构与树突棘发生之间的联系。在双色成像实验中，研究团队发现了树突主干上存在许多动态的小突起，这种突起结构的尺寸大多小于传统双光子成像技术的解析能力，只能通过超分辨成像进行动态分析。动态观察显示，树突主干上的PSD-95聚团附近存在着频繁的小突起生成现象。通过对一段时间内的动态进行统计分析，研究团队发现树突主干上的PSD-95聚团和主干上的小突起存在着显著的共定位现象。这一新发现的小突起结构及其与PSD-95的共定位可能暗含树突棘发生的细胞机制，为未来的突触可塑性研究提供了新的证据。

总结而言，该研究开发了一种新型超分辨成像技术，同时解决了背景噪声干扰和运动伪影两大技术难题，填补了在清醒动物中开展超分辨成像的技术空白。该技术的出现使得在清醒动物生理状态下对神经元及其他细胞的亚细胞微观动态进行长时间、大范围的成像和分析成为可能。这一关键技术进步为超分辨成像在神经科学领域的广泛应用奠定了基础，为神经科学研究提供了新的有力工具。

中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）的博士毕业生张宇杰为该研究的第一作者，白璐，王鑫，赵钰琛，张田蕾和叶立晨参与了课题的研究，脑智卓越中心张哲研究员、杜旭飞博士和杜久林研究员参与指导了该项工作，王凯研究员为本论文的通讯作者。这项研究得到了科技部、国家自然科学基金委、上海市及中国博士后科学基金的经费资助。

多模式复用结构光线照明超分辨显微成像技术MLS-SIM应用于清醒小鼠皮层超分辨成像

图注（a）MLS-SIM照明范式示意图。（b）清醒小鼠脑皮层神经元形态的超分辨成像结果。LC：线共聚焦成像；LCDeconv：经过反卷积处理的线共聚焦成像；MLS-SIM：超分辨成像。标尺，5微米。（c）小鼠脑皮层不同深度成像的结果。标尺，2微米。（d）超分辨观察到树突棘尖刺的快速和长时程动态。标尺，1微米。（e）双色成像树突棘形态和PSD-95蛋白。紫色：膜标记mRuby；绿色：EGFP标记的PSD-95。标尺，500纳米。