2023年5月25日，《Nature Methods》期刊发表题为《Development of miniature base editors using engineered IscB nickase》的研究论文，该研究是在中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）杨辉研究员的指导下，对IscB系统进行了大量优化和改造，成功得到在人类细胞内具有高效编辑活性的IscB系统（enIscB）。通过融合腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶结构域，开发出高活性的迷你型单碱基编辑器miABE和miCBE，该研究将进一步推动DNA单碱基编辑领域进入迷你型的“新时代”。 

　　CRISPR-Cas9系统自发现以来，已经被广泛应用于生命科学基础研究，遗传疾病基因治疗，动植物育种改良等领域。基于具有缺口酶活性的nCas9(Cas9 nickase)和腺苷/胞苷脱氨酶结构域结合的碱基编辑器可实现A-to-G，C-to-T和C-to-G的碱基替换(Gaudelli et al., 2017; Komor et al., 2016; Kurt et al., 2021; Zhao et al., 2021)。最近，杨辉团队通过对糖基化酶（MPG）的改造，开发出了A-to-Y的腺嘌呤碱基编辑器（AYBE）和不依赖脱氨酶的鸟嘌呤碱基编辑器（gGBE），极大地拓展了碱基编辑的应用范围(Tong et al., 2023a; Tong et al., 2023b)。由于DNA碱基编辑不依赖双链断裂，具有更安全，更精准的特性，使得其在遗传疾病治疗中展现出了广阔的应用前景。然而由于Cas9的体积过大，基于nCas9的碱基编辑器难以实现单个AAV的包装递送，极大限制了在体基因编辑的发展应用。近年来，一系列Cas12f等小型高活性Cas蛋白被报道(Harrington et al., 2018; Kim et al., 2022; Kong et al., 2023; Wu et al., 2021; Xu et al., 2021)，推动了基因编辑工具迈向了小型化时代，然而由于Cas12蛋白结构域组成的差异，难以被通过改造为nickase变体来开发高效的迷你型碱基编辑器。张锋实验室重建CRISPR-Cas9系统的进化起源(Altae-Tran et al., 2021)，发现了由IS200/IS605转座子超家族中一类核酸酶IscB，其被认为是Cas9蛋白的远古祖先，与Cas9蛋白具有相似的结构域组成。然而，IscB蛋白的大小只有约500个氨基酸，不到SpCas9的2/5。IscB被证明通过ωRNA引导，可对双链DNA靶位点实现特异性的切割。其中，OgeuIscB被报道在哺乳动物细胞内存在微弱的编辑活性，使得通过"驯化"野生型IscB蛋白来开发高效极小型的碱基编辑工具存在一定的可行性。 

　　之前的研究表明向导RNA对编辑工具的活性具有一定的影响，因此杨辉研究团队结合已报道的ωRNA结构(Kato et al., 2022; Schuler et al., 2022)，在ωRNA四个区域内分别进行优化，利用高通量真核细胞报告系统筛选后，得到了高活性ωRNA变体。为了进一步提高编辑活性，研究人员将IscB蛋白的氨基酸依次替换为精氨酸（R），从而筛选得到提高编辑效率的一系列突变位点，最终开发得到了高活性IscB系统enIscB。 

　　此外，他们将enIscB与T5外切酶融合表达，发现在HEK293细胞中多个位点可以实现与SpG Cas9相当的编辑效率。PEM-seq脱靶分析也证明，融合T5外切酶后IscB的造成的染色体易位水平有了明显的降低。 

　　在此基础上，研究人员将IscB的 RuvC和HNH结构域的区域关键催化位点的氨基酸替换为丙氨酸（A），利用报告系统筛选得到的D61A变体具有最高的切口酶活性，将该变体分别与腺苷脱氨酶（TadA8e^V106W），胞苷脱氨酶（APOBEC3A^W104A）和尿嘧啶糖基化酶抑制子（UGI）融合表达，通过不同的结构组合筛选，研究团队确定了最优的ABE和CBE结构，分别命名为miABE和miCBE。多个真核细胞内进行内源位点的验证也表明它们具有高效的（最高达92%）的编辑效率，展现出巨大的应用潜力。 

　　该研究基于IscB优化改造，开发出高活性迷你型碱基编辑工具，有望解决现有基因编辑工具过大带来的递送难题，有助于推动在体基因编辑的应用与发展，使得通过单个AAV递送CBE或GBE成为可能，将进一步拓宽基因编辑的应用场景，加速基础科学研究和基因治疗的发展。 

　　该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心和辉大（上海）生物科技有限公司合作完成。脑智卓越中心博士研究生韩鼎毅，王一凡，脑智卓越中心与辉大基因联合招收博士后肖庆全，张海南博士为该论文的共同第一作者。辉大基因创新研究院执行院长周英思博士和脑智卓越中心、辉大基因创始人&首席科学顾问杨辉博士为该论文的通讯作者。