基因编辑工具开发及安全性评价

CRISPR-Cas9 基因编辑技术自问世以来具有广泛的临床应用前景，然而其介导的DNA 双链断裂（DSB）会造成严重的脱靶问题，存在巨大的安全隐患。单碱基编辑工具自2016 年出现以来，具备精确和高效的编辑效率而且无需造成DNA 双链断裂，被视为比CRISPR-Cas9 技术更安全的基因编辑工具。然而由于基因编辑脱靶检测技术的局限性，各种基因编辑工具的脱靶风险一直备受关注。近年来，科研人员推出过多种检测脱靶的方案，这些方案或者依赖于计算机软件预测，或者依赖于高通量测序检测DSB 产生，还有体外检测的方案。这些方案都存在一定的局限性，不能高灵敏性检测到脱靶突变，尤其是单核苷酸突变。因此关于CRISPR-Cas9 及其衍生工具的真实脱靶率一直存在争议。科学家们希望可以找到一种既能够不依赖于脱靶位点预测，又能有足够信噪比的精密脱靶检测手段。本实验室开发的GOTI 的检测技术完全满足了上述两点，并使用该技术发现，BE3 存在非常严重的脱靶，而且这些脱靶大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现的位点，因此之前方法一直没有发现其脱靶问题。这一发现也让世人重新审视了这些新兴技术的风险。更重要的是，此工作建立了一种在精度、广度和准确性上远超越之前的基因编辑脱靶检测技术，有望由此开发精度更高、安全性更大的新一代基因编辑工具，建立行业的新标准。同时，我们通过全转录组RNA测序发现DNA编辑工具单碱基编辑技术存在大量的RNA脱靶，首次证明了BE3、BE3-hA3A和ABE7.10等多个单碱基编辑技术均存在大量的RNA脱靶，并且ABE7.10还会导致大量的癌基因和抑癌基因突变，具有较强的致癌风险。该研究进而通过点突变的方式对三种单碱基编辑工具进行突变优化，使其完全消除RNA脱靶的活性，首次获得三种更高精度的单碱基编辑工具，为单碱基编辑基础进入临床治疗提供了重要的基础。

利用基因编辑技术构建动物模型

CRISPR-Cas9系统是一种非常高效的基因编辑方法，但是大部分被基因编辑过的动物都有嵌合性，也就是说它们只有一部分细胞的基因发生了编辑。对于涉及表型的研究而言，嵌合的基因编辑动物需要进一步地杂交育种，才能得到完全的基因敲除动物。本实验室开发的简称C-CRISPR（Cocktail CRISPR）技术能同时产生插入缺失和外显子删除，从而实现高效的基因完全敲除，并且获得了F0代Prrt2基因功能完全敲除的具有阵发性运动障碍表型的食蟹猴模型。将C-CRISPR与单碱基编辑系统结合，通过对基因编辑引入多个终止密码子的方式，成功实现F0代小鼠多个功能基因-完全敲除。C-CRISPR及单碱基编辑方法可以高通量制作各种基因完全敲除小鼠用于表型分析，并快速制作基因敲除小动物、大动物模型。

推动基因编辑应用于成体疾病治疗

在临床治疗应用方面，精确的靶向基因组编辑至关重要。目前我们有但不限于以下方法应用于疾病治疗，以HMEJ为基础的靶向整合策略、单碱基编辑技术、SPH激活系统。常用的同源重组（HR）策略介导的基因靶向整合在动物胚胎和组织中效率低下。我们设计了一种新的以HMEJ 为基础的靶向精确整合策略，其效率远高于以HR为基础的策略。使用该策略，我们成功的治疗了Fah 基因突变的肝损伤模型小鼠。HMEJ 介导的基因敲入方法拥有更高效的编辑效率和更好的精确度，为疾病的大片段靶向基因治疗等应用提供了非常大的前景。同时，我们拟使用改造后无脱靶效应的的单碱基编辑系统应用于单碱基突变的疾病治疗。单碱基编辑系统可以不造成DNA双链断裂情况下就定向修复单碱基突变，在原理上更加安全与高效。除此之外，我们开发出一种比以往更加强大的激活系统（SPH），在人和小鼠的细胞上分别验证了SPH系统的高效性。同时，体内实验也证明了可以利用SPH小鼠在脑内实现复杂基因网络的调控。该体内激活系统的建立，不仅为在脑内研究复杂的基因网络以及获得性的表型提供重要的技术手段，而且为将来进一步治疗表观遗传疾病提供了理论基础。