CRISPR/Cas9基因编辑技术以其高效性和特异性，自从2012年被发明以来备关注。学术界普遍认为基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的临床技术将为人类的健康做出巨大贡献。然而值得注意的是，其脱靶风险一直令人担忧。将CRISPR/Cas9及其衍生工具用于临床，脱靶效应可能会引起包括癌症在内的很多副作用。研究人员推出过多种脱靶检测方法，然而这些方法都存在一些局限性，不能高灵敏性检测到脱靶突变，尤其是单核苷酸突变。因此关于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真实脱靶率一直存在争议。精确，灵敏的脱靶检测技术是CRISPR/Cas9及其衍生工具应用于临床，治疗疾病的关键因素。 

　　为了实现以上目标，科研人员建立了一种被命名为“GOTI”的新一代基因编辑脱靶检测技术。该技术使用携带CAG-LSL- tdTomato基因结构的Ai9转基因公鼠与野生型母鼠杂交产生具有CAG-LSL-tdTomato基因结构的受精卵。受精卵发育到2-cell后期，向一个卵裂球中注射含有Cre mRNA和基因编辑系统的RNA，Cre酶会剪切掉LSL结构， tdTomato基因开始表达红色荧光蛋白，构成一个基因编辑的细胞会被标记成红色的系统。胚胎在受体小鼠子宫内发育到胚胎14.5天，取出并将胚胎酶解消化成单细胞，流式细胞仪分选出红色荧光蛋白阳性和阴性细胞，分别抽取DNA，高通量全基因组测序。由于实验组和对照组来自同一枚受精卵，理论上基因背景完全一致，因此直接比对两组细胞的基因组，之间的差异可以认为是基因编辑工具造成的。 

　　利用GOTI技术，研究人员发现经典的单碱基编辑工具BE3会导致基因组范围内完全随机无法预测的脱靶效应，不能应用于临床治疗 ^[1]。随后，利用高灵敏GOTI技术，在结构生物学指导下建立了新一代高保真单碱基编辑工具YE1-BE3-FNLS，解决了单碱基编辑工具的脱靶问题，打破了临床应用的瓶颈^[2]。在GOTI技术支持下，建立A3G-CBE单碱基编辑系统，解决CCC motif编辑特异性问题^[3]。相关研究成果分别发表于Science、Nature Methods和Science Advance杂志。 

　　2020年8月14日，应Nature Protocols期刊邀请，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心杨辉研究组、中国科学院上海营养与健康研究所隶属的计算生物学研究所（中国科学院-马普学会计算生物学研究所）李亦学研究组、斯坦福大学Lars M. Steinmetz研究组合作以“GOTI, a method to identify genome-wide off-target effects of genome editing in mouse embryos”为题，详细描述GOTI技术细节，与全球基因编辑领域科学家共享高精度，高灵敏性脱靶效应检测技术。 

　　该研究杨辉研究员，李亦学研究员，Lars M. Steinmetz教授为共同通讯作者，左二伟研究员，孙怡迪研究员，魏武研究员，袁堂龙助理研究员为共同第一作者。本项目得到科技部，中科院，上海市的资助。 

　　GOTI技术细节：a.小鼠2-cell注射，高通量测序；b.生信分析。 

　　参考文献： 

　　1. Zuo, E., Sun, Y., Wei, W., Yuan, T., Ying, W., Sun, H., Yuan, L., Steinmetz, L. M., Li, Y. & Yang, H. (2019) Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364:289-2922.  

　　2. Zuo, E., Sun, Y., Yuan, T., He, B., Zhou, C., Ying, W., Liu, J., Wei, W., Zeng, R., Li, Y. & Yang, H. (2020) A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects. Nature Methods. 17:600–604 

　　3. Lee, S., Ding, N., Sun, Y., Yuan, T., Li, J., Yuan, Q., Liu, L., Yang, J., Wang, Q., Kolomeisky, A. B., Hilton, I. B., Zuo, E. & Gao, X. (2020) Single C-to-T substitution using engineered APOBEC3G-nCas9 base editors with minimum genome- and transcriptome-wide off-target effects. Science Advances. 6:eaba1773