在临床治疗应用方面，精确的靶向基因组编辑是非常重要的。规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）/CRISPR相关蛋白-9核酸酶（Cas9）系统通过在基因组上靶向形成DNA双链断裂（DSB）的方式极大地促进了转基因的靶向整合。一旦产生一个DSB，靶向整合可以通过多种策略来实现，包括同源重组（HR）、微同源臂介导的末端接合（MMEJ）或者非同源末端接合（NHEJ）。

常用的同源重组（HR）策略介导的基因靶向整合在动物胚胎和组织中效率低下。而且NHEJ介导的修复系统会导致随机方向的整合，以及在接合处引入各种形式的插入、删除或突变，使得这种方法难以通过同框整合的方式形成内外源融合基因以形成嵌合蛋白。即使是之前报道的MMEJ策略，也只能在某些系统内提高效率。因此，研究者们试图探究是否存在一种在多个系统内都可以有更高效的编辑效率和更好的精确度的基因靶向整合策略。

在本工作中，研究团队基于CRISPR/Cas9系统，设计了一种新的以HMEJ为基础的靶向精确整合策略，即利用带有单个向导RNA（sgRNA）靶向位点和长同源臂（约800bp）的供体载体来实现高效的精确整合。

为了验证这一想法，研究团队构建了四种类型的供体载体来比较敲入效率： HMEJ供体（sgRNA靶向位置序列加在800bp长度的同源臂两端）、HR供体（只有800bp长度的同源臂）、NHEJ供体（只有sgRNA靶向位置序列）以及MMEJ供体（sgRNA靶向位置序列加在20bp的微同源臂两端）（图A）。然后将这四种系统分别在体外培养的细胞系，小鼠和猴胚胎以及成体组织上进行效率比较。

研究者发现在体外培养的小鼠ES细胞和N2a细胞中，HMEJ为基础的定向整合效率与HR方法相比较并无显著提高。然而，在原代星形胶质细胞和神经元细胞中，HMEJ方法具有很高的DNA敲入效率。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎中展现了非常强大的基因敲入能力（图B）。此外，通过尾静脉水动力注射法感染成体小鼠的肝细胞，发现HMEJ介导的基因敲入效率远高于以HR、NHEJ和MMEJ为基础的策略（图C&D）。采用AAV定点注射感染小鼠的视皮层区（V1），结果显示HMEJ介导的在成体非分裂的成熟神经元中靶向整合效率可以达到50%左右（图E&F）。最后，研究者对HMEJ介导的基因靶向整合的机制进行了探讨（图G）。

该工作建立了一种新的基于HMEJ的靶向精确整合策略，即利用带有单个向导RNA（sgRNA）靶向位点和长同源臂（约800bp）的供体载体来实现高效的精确整合。HMEJ介导的基因敲入方法拥有更高效的编辑效率和更好的精确度，为包括基因编辑动物模型的建立和疾病的靶向基因治疗等应用提供了非常大的前景。

该项工作由博士研究生姚璇、王兴、刘真与研究实习员胡新德在灵长类疾病模型研究组杨辉研究员、基因编辑平台主任施霖宇博士与苏州非人灵长类研究平台主任孙强博士的指导下完成，课题组的其他成员积极参与，并得到了神经所程乐平研究员，上海科技大学黄鹏羽研究员的大力协助，是众多课题组通力合作的重要成果。

图注：（A）HR、NHEJ、MMEJ和HMEJ介导基因敲入的示意图。HAL/HAR，左/右同源臂。三角形，sgRNA靶向位点。（B）在囊胚阶段，HMEJ介导的基因编辑后的小鼠以及猴胚胎的代表性荧光图片。插入图，高放大倍数图。（C）尾静脉注射后第7天，肝切片中具有代表性的肝细胞的荧光图。标尺，50μm。GFP，转染后的细胞。（D）通过统计在GFP阳性细胞中mCherry阳性细胞比例来说明相对敲入效率。肝细胞在注射后7天进行收集分离。数据点用黑点表示。***P<0.001，不配对T检验。（E）HMEJ-AAV注射后大脑切片中具有代表性的神经元荧光图。插入图，高放大倍数图。标尺，100μm。（F）通过分别统计在GFP阳性细胞或所有DAPI阳性细胞中的mCherry阳性细胞的比例来说明相对或绝对敲入效率。每张大脑切片中至少统计2000个细胞，每个动物中至少统计三张大脑切片。输入的数据点用黑色点表示。（G）HMEJ介导的基因敲入的示意图。