2023年5月11日，《Cell Reports》期刊在线发表了题为《Epistatic genetic interactions between Insm1 and Ikzf2 during cochlear outer hair cell development》的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、神经科学国家重点实验室刘志勇研究组完成。该研究解析了小鼠耳蜗外毛细胞(outer hair cell, OHC)中两个核心转录因子Insm1和Ikzf2之间的遗传学层级关系，为进一步理解耳蜗外毛细胞的命运决定和维持的分子机制提供了新的理论基础，也为耳蜗外毛细胞的再生修复提供了新的思路。  

　　外毛细胞位于耳蜗听觉上皮（又称柯蒂氏器），是声音放大器。外毛细胞的机械运动激活内毛细胞，从而把声音信息传递到听觉神经元。外毛细胞的先天发育异常和各种耳毒性或者衰老引起的后天损伤均会引起严重的听力损伤。目前临床上尚无有效的方法对外毛细胞损伤进行功能性修复。因此，解析外毛细胞的命运决定和分化的分子机制对未来再生修复外毛细胞损伤至关重要。在外毛细胞分化的早期，转录因子Insm1瞬时且特异表达。在外毛细胞分化的晚期和成年，转录因子Ikzf2开始并永久表达。Insm1和Ikzf2基因突变均可以引起外毛细胞发育和功能异常，但两者之间的相互作用关系至今尚未可知。 

　　在该研究中，研究人员利用小鼠遗传学方法解析了Insm1和Ikzf2在小鼠耳蜗外毛细胞发育过程中的相互关系。首先，研究人员在小鼠毛细胞中异位过表达Insm1，发现在小鼠出生后第7天（P7）时，Ikzf2和外毛细胞另外一个特异基因Prestin均可在内毛细胞中被活化。这表明Insm1可以诱导Ikzf2的异位表达（图一）。第二，在幼年（P5）Insm1条件性敲除的小鼠中, Ikzf2的起始表达不受影响，但是在成年Insm1条件性敲除的小鼠中，Ikzf2的表达在部分外毛细胞中消失。这表明Insm1为调控Ikzf2的上游转录因子。虽然Insm1的敲除对Ikzf2的表达起始无影响，但是Insm1是Ikzf2在外毛细胞中持续性表达进而维持外毛细胞成熟特性的关键。 

　　图一：Insm1诱导Ikzf2的异位表达。（A-B’’’）对P7的对照组（A-A’’’）和Insm1过表达实验组（B-B’’’）进行外毛细胞标记基因Prestin、Ikzf2（带V5标签）和内毛细胞标记基因vGlut3的免疫组化染色。箭头指示一颗内毛细胞由于Insm1的异位表达而产生了Prestin和Ikzf2。（C）统计实验组耳蜗底圈（base）、中圈（middle）和顶圈（apex）中Prestin阳性的内毛细胞比例。（D）统计实验组耳蜗底圈、中圈和顶圈中Ikzf2阳性的内毛细胞比例。（E）示意图简略勾画了异位表达Insm1之后的细胞变化。 

　　为进一步验证Ikzf2是Insm1下游的关键因子，研究人员在小鼠Insm1^-/-外毛细胞中回补外源性Ikzf2。Insm1^-/-外毛细胞丧失了其本来的分子（Prestin）和形态学(V形的纤毛)的特征，这些特征能被外源性Ikzf2部分恢复（图二）。为进一步验证Ikzf2与Insm1在外毛细胞发育过程中属于同一通路，研究人员将Insm1和Ikzf2在小鼠耳蜗中同时敲除。实验结果表明，在Insm1和Ikzf2同时缺失后，小鼠耳蜗外毛细胞的发育异常表型与Insm1的单独敲除没有显著性差异。上述小鼠遗传学的实验结果准确地阐明了在小鼠耳蜗外毛细胞发育过程中转录因子Insm1和Ikzf2的上下游关系，为深入理解外毛细胞分化的分子机制和外毛细胞的再生修复损提供了新的实验依据。 

　　图二：外源性Ikzf2可以部分回补Insm1敲除后表型。（A-C’’’） 对P30的对照组（A-A’’’），Insm1单独敲除的实验组（B-B’’’），Insm1敲除Ikzf2过表达的实验组（C-C’’’）进行外毛细胞标记基因Prestin、Ikzf2（带V5标签）和内毛细胞标记基因vGlut3的免疫组化染色。（B-B’’’）中的箭头指示一颗转分化的毛细胞；（C-C’’’）箭头指示一颗外毛细胞表达微弱的vGlut3信号，三角形指示一颗只表达Prestin不表达vGlut3的外毛细胞。（D-E）在Insm1单独敲除和敲除并过表达Ikzf2的实验组中，vGlut3阳性外毛细胞细胞（D）和Prestin阳性的外毛细胞（E）的占比。（F）示意图表示外源性Ikzf2可以部分回补Insm2敲除后导致的外毛细胞向内毛细胞的转分化表型。 

　　　中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心刘志勇研究员为该论文的通讯作者；脑智卓越中心博士研究生李书亭为该论文的第一作者；高级实验师贺顺姬，实验员陆颖，暨南大学贾世奇研究员对本课题也做出了重要贡献。中科院脑智卓越中心光学成像平台及实验动物平台（实验鼠房）予以本项目有力支持。该研究得到科技部、中国科学院、国家自然基金委员会和上海市的支持。