“起初神创造天地，地是空虚混沌，渊面黑暗，神的灵运行在水面上。神说，要有光，就有了光。神看光是好的，就把光暗分开了。”创世纪中这段话表明，是光照亮了混沌的天地。对我们而言，大脑是什么样子的呢，它是什么结构呢？即使把它打开，我们也无从得知它的工作原理。大脑这片混沌的世界，即使我们拥有它，它却是个谜。但是，让我们大开脑洞地想象一下，假如，大脑的世界里有了光呢？ 

　　2007年，哈佛大学的神经生物学家杰夫？W？里奇曼（Jeff W. Lichtman）和他的团队研发了一项名叫“脑彩虹”（Brainbow）的技术，他们利用荧光蛋白能让小鼠的神经细胞同时显示出几十种不同的色彩。这些荧光蛋白，照亮了黑暗的大脑，使某些需要研究的细胞光明，从而与错综复杂的黑暗背景区分开来。从此，大脑这片混沌天地不仅有了光，还是不同颜色种类的光。通过对不同色彩的分析，可以计数细胞，也可以追踪细胞的走向，观察神经网络的连接布局以及细胞之间的相互作用。大脑这片天地有了光，就好像创世纪一般，开始进入全新的世界了。如果借助传统技术完成这项任务，可能需要数十万年时间。这一次，开天地的，不是神，而是科学家。他们是怎样走到这一步的呢？就让我们来看看大脑的发光之路。 

　　图片来源：Livet, J., et al. (2007). "Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system."Nature 450(7166): 56-62. 

　　20世纪初，科学家们利用组织及细胞自发荧光来观察研究原生动物。会发光的细胞，就像人群中穿着不一样颜色衣服的人，不会淹没在人群中。一眼望去，很容易发现他。但是天然荧光生物分子种类有限，强度较弱，而且大多数分子是不发光的。于是，科学家们研究出了荧光探针技术，将那些原本不发光的生物分子标记上荧光分子，使得他们在周围组织和细胞中像黑暗中的星星那样闪闪发光，可以轻易被人们的视线捕捉到。 

　　那么，这些人造的荧光从何而来呢？故事要从我们“衣食住行”中的“衣”讲起。人类在发明纺织的同时，也发展了染色技术。刚开始的时候，人们只是运用天然染料，例如，植物的花、叶、树皮，矿物中的朱砂、雄黄等。直至19世纪，英国人发现笨胺紫能将丝织品染成紫红色，继而开创了化学合成染料的工业纪元。等等，我们不是要讲大脑的荧光吗？怎么还讲到纺织业了呢？其实，看似无关的领域，科学家们可是触类旁通：既然染料可以染纺织品，为什么不能用来染生物体呢？20世纪30年代起，这些有机小分子染料开始被用于活体细胞和组织的荧光显微成像染色。 

　　仅有光是不够的，我们不能照亮所有的区域，我们要只照亮感兴趣的区域，这就需要荧光探针具有特异性。如何做到呢？除了荧光基团，荧光探针分子还有识别基团和连接体部分。识别基团是探针的“向导”，决定探针分子的选择性和特异性，负责找到感兴趣的基团。连接体负责连接识别基团和荧光基团。这样的结构，起到了识别基团找到了感兴趣的分子的同时，荧光基团也就被一起“绑”在上面了的作用，感兴趣的分子这样和黑暗分开了。有机小分子具有强大的可塑性和应用潜力，通过对其结构进行巧妙设计和改造，能够设计合成出满足各种需要的荧光探针。当下，已经有细胞活性探针、膜荧光探针、细胞器探针、电位敏感探针、活性氧探针等功能各异的探针。他们被用于研究大脑结构和功能的方方面面。 

　　有机小分子荧光探针的几种机制 

　　锌是重要的神经化学因子，与大脑发育和智力有关。当锌含量过高或过低时，就会导致多种疾病，而直接检测离子含量并不容易，荧光探针对此却易如反掌。它可以将离子浓度转化为荧光强度，通过显微镜成像，我们就可以间接检测出锌离子含量。它是如何实现的呢？首先，它的识别基团——邻氨基苯硫醚可以和锌离子结合，荧光基团是香豆素，两者以席夫碱相连，席夫碱抑制了香豆素的发光。所以这个探针平时是黑暗的。但是当锌离子存在时，可以与识别基团上的硫原子、连接体上的氮原子和荧光基团上的氧原子配位，整个荧光探针分子构象变化，香豆素回到了可以发光的构象，让荧光从无到有，光明表示着锌离子的存在。 

　　虽然有机小分子可塑性良好，但是一些有机小分子荧光探针的非水溶性及毒副作用、光漂白性等，使其在生命科学、医学等领域中的应用受到了限制。 

　　1955年，有人发现水母可以发绿光，但不知其原因。1962年，日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）和美国科学家约翰森（Frank H. Johnson）从水母中分离生物发光蛋白——水母素时，意外地发现了一个副产物——绿色荧光蛋白（GFP），它在阳光下呈绿色。1974年，他们提取到了这种蛋白质。 

　　GFP发光原理（来源于网络图片） 

　　GFP的发光过程需要发光蛋白Aequorin的帮助。水母体内的Aequorin与钙离子结合会发出蓝光，蓝光会立刻被一种蛋白吸收，发出绿色荧光。 

　　20世纪80年代，美国科学家普鲁切（Douglas Prasher）成功地克隆出了水母中编码绿色荧光蛋白的基因，使得荧光蛋白标记的大量应用成为可能。1994年美国科学家沙尔菲（Martin Chalfie）利用PCR技术扩增了GFP的编码区，成功地将它克隆到大肠杆菌和线虫细胞中，通过紫外线或蓝光激发，均产生了很美妙的绿色荧光。沙尔菲的这项研究首次证实了GFP作为发光标记物用于生物学研究的价值，这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破。 

　　由于荧光蛋白的“发光”基本不需要外来物质“刺激”，并且具有极佳的稳定性，对生命体也无毒害，因此，荧光蛋白可以在各种有机生命体内“点亮”科研人员想要研究的分子或者基因。 

　　尽管野生型GFP能发出很绚丽的荧光，但它还是有不少缺点，比如有两个激发峰、光稳定性不好、在37℃不能正确折叠等。生物学家们发挥主观能动性的的时候到了。1994年，美籍华裔科学家钱永健首次完成对GFP发光基团周围残基的重大改造，得到了多种改良型的GFP。改良过的GFP增强了其光谱性质、荧光强度和光稳定性，折叠能力也得到改善，颜色也从原来的绿色荧光蛋白到现在的蓝色、蓝绿色、黄色荧光蛋白。 

　　基于以上研究，下村修、沙尔菲和钱永健获得了2008年的诺贝尔化学奖，荧光蛋白的研究也被称为“点亮”科学。值得八卦一下的是，普鲁切并没有得到诺奖，作为发现GFP基因并把它免费馈赠给这些诺贝尔获奖者的科学家，普鲁切最终却因为找不到一份科学领域的工作，成了一位开巴士的司机，令人扼腕叹息。 

　　来自钱永健实验室的荧光细菌画（来自钱永健实验室） 

　　在科学界，荧光蛋白被称为生物化学的“北斗星”。通过常规的基因操纵手段，用荧光蛋白来标记目标蛋白，可以跟踪和判断生物细胞的实时分子变化，了解以前看不到的生物过程，例如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导，肿瘤细胞的转移等过程。因为色彩鲜艳，荧光蛋白甚至被应用到商业领域，2003年美国约克镇的家庭宠物荧光鱼就是其商业应用的首个案例。 

　　（图片来源：新闻网页） 

　　但是在脑科学研究领域，要想把数量庞大、错综复杂的神经细胞彼此区分开，还需要更新的技术。不仅如此，神经细胞之间的联系更是错综复杂。每个细胞就好像一个立交桥，可以把自己的信号传到成千个细胞，同时也可以接受成千个细胞的信号输入。如果我们的技术只停留在看到一团神经细胞，分不清他们谁是谁，我们怎么研究这样复杂的大脑呢？恐怕连盲人摸象的水平都不如。脑彩虹技术解决了区分单个神经细胞的方法，使不同的神经元呈现不同的颜色。但是，这是如何实现的呢？因为我们荧光蛋白的种类虽然已经很多了，但是仍然是有限的，不可能做到每种神经元都携带一种颜色的水平啊。但是我如果问你，你画出的画有很多种颜色，你是否也需要成千上万种颜料呢？你会觉得我傻啊，因为颜色是可以调的，只要有几种基础颜色，这个多一点，那个少一点，就可以配出五彩缤纷的色彩。同样地，我们的科学家也利用了这样的思路，他们让小鼠的每个神经细胞同时拥有红、绿、黄、蓝、青等几种荧光蛋白，通过调控各自的比例，就可以产生特定的色彩。怎样控制这些神经三原色的比例呢？这就需要转基因手段了。为了达到这一目标，科学家们下了一局很大的棋。他们在神经系统发育早期，就利用Cre-Lox 重组方法改造了神经干细胞。干细胞每次增殖都会产生两个一模一样的姊妹细胞，它们的基因一样，颜色也是一样的。但是这两个姊妹细胞的子代，基因会因为重组而和亲代有所不同，颜色也就会由于重组丢失不同的荧光蛋白而发生变化。最后达到成熟的神经细胞，携带着不同的基因，也就具有独特的红、黄、蓝荧光蛋白比例，产生特定的颜色。 

　　但是要拍出好看的照片，光有一张漂亮的脸是不够的，相机本身也很重要。要不怎么有“单反穷三代”这样的说法呢？无论是对有机小分子荧光探针的研究，还是对荧光蛋白的改进，都好像是把拍照的人变美了。所谓好马配好鞍，检测荧光信号的荧光显微镜的研究怎么能落后呢？现如今，三光子激发、光子随机重构、光激活和光转换荧光蛋白、振镜扫描、高速摄像机等，都是从成像原理上进行改进，有效地提高了显微镜的时间空间分辨率和观察深度。荧光蛋白和荧光显微镜的结合，完全是“你负责貌美如花，我负责赚钱养家”的节奏。现如今，高分辨率的核磁成像也加入到了荧光扫描的队列中。 

　　最后，让我们来欣赏一些闪闪发光的神经元吧。他们在被“点亮”之前，没有人知道他们在哪里，长什么样，又在做些什么，整个大脑就像一片未知的混沌。如今，得益于荧光蛋白，大脑也开始揭开它神秘的面纱。 

　　（图片来源：小鼠海马来源于Livet, J., et al. (2007). "Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system."Nature450(7166): 56-62.；小鼠背侧中缝核的5-羟色胺神经元的全脑投射：周立摄制；小鼠视网膜神经节细胞：王飞 摄制） 

　　（审核:胡谦、顾勇） 

　　参考资料 

1. 　　Livet, J., et al. (2007). "Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system."Nature450(7166): 56-62. 

2. 　　http://www.huffingtonpost.com/2013/10/31/nikon-small-world-photos_n_4182182.html