透射电镜样品取材须知
发布时间：2019-06-19
取材是电镜样品制备的第一步，也是十分重要的一步。其操作成功与否直接关系到整个实验的成败。
一.取材的基本要求：快、冷、小、净、准。
快：就是指在血液未停止流动（未凝血）前取材。因为一旦组织失去血流供应，细胞就处在缺氧状态，代谢发生改变，细胞内的一些酶将释放出来使细胞自溶，破坏超微结构形态。所以当组织离体后应即刻予以固定。
冷：在取材时尽量保持低温操作，使酶的作用降低，减少对细微结构的影响。一般要求取材温度控制在0-4℃。
小：由于受电镜固定液及包埋剂渗透速度的影响，因此，一般不允许组织块的大小超过1mm3。取材时动作要轻，刀锋要利，切组织时刀片沿着一个方向切，避免任何牵拉和挤压造成的机械损伤。
净：尽量少带血液和组织液进入固定液。但切忌用水直接冲洗，可用缓冲液（0.1M PBS）或等渗盐水（0.9%NS）把表面的血液和组织液轻轻冲掉。
准：为避免“一孔之见”等电镜研究固有的局限性，要求在取材时选择部位准确可靠，即取材的组织小块必须为要求观察的部位。
二. 具体方法：
1.组织固定法：
固定组织的方法为心脏灌注法，固定液的选择与不同的神经递（调）质有关，一般来说，对于神经肽以及分子量较大的多肽和蛋白质，用含4%多聚甲醛、0.1-0.5%戊二醛或0.2%苦味酸的0.1M磷酸缓冲液(PB)(PH7.2-7.4)。组织固定法以大鼠为例，首先用50毫升生理盐水（37℃）清洗血液，接着用50毫升固定液（37℃）快速灌注固定，然后用250-300毫升冷固定液（4℃）慢速灌入，持续10-15分钟后取材，置组织于同样固定液中，在4℃冰箱中后固定。
2.振动切片：
将所需组织修成适当大小的组织块，为了易于切片，组织块的高度不应超过其长或宽度，用502胶将组织粘于振动切片机的样品台上，尽量将组织块中的重要部分迎向切片刀口（市场上的双面剃须刀）。切片厚度为50-70微米。
3.实质性器官：实质性组织切成正方体小块2×2×2mm3。组织块被剪刀剪切或镊子夹过的部分弃去，然后用牙签将组织小块轻轻挑起，放入装有固定液的小管中浸泡固定。也可用镊子借液体的张力移取组织块，注意不可用力夹。小管置于4℃冰箱中保存。每份样本的组织小块需≥5块。例如：
肝脏：切除被膜，切成立方体小块。
肾脏：分为皮质与髓质。根据实验的要求取相应部位，切除包膜，切成立方体小块。
肺脏：同肝脏取材，但因肺中有大量的肺泡及细支气管，所以在固定时小块会漂浮在固定液液面上，需用空针抽真空，使小块完全浸没在固定液中。
4.有方向性的器官：切成长方体小块（1×1×2 mm3）。
注：观察面即为长方体小块的宽面（图上阴影部分）！
肠、血管：此类管腔型组织，在固定时要将其剖开，使内膜面得以充分的固定，如不剖开而直接浸在固定液中，由于固定液渗透时间的影响，进入内膜面需要一定时间，这样内膜面的超微结构已经改变。管腔型组织需切成长方体小块，
肌肉、神经：此类组织也存在横切和纵切的差别，所以也要切成长方体小块。
心脏：如果可辨清肌纤维方向，则按照肌肉取材。否则同肝脏取材。
5.培养细胞、细菌的电镜样品制备：
将细胞连同培养液放在尖头离心管中离心5min，2 000r/min，后弃上清液，加入4%多聚甲醛（0.1mPBS配制，pH7.4），并用滴管轻轻吹打，使细胞悬浮于固定液中，并在4℃下固定4h和过夜。由于电镜样本制备过程中会不可避免地损失掉一部分细胞，因此细胞必须达到一定数量，即为离心后细胞量至少为黄豆样大小。
特殊样品请咨询我室工作人员，可致电021-54921722！
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